基于同尾酶的BioBrick法和BglBrick法。同尾酶是識(shí)別不同的?DNA?序列但是能切出相同黏性末端的一類限制性內(nèi)切酶，比如?XbaI?和?SpeI，但其切開的末端相互連接后不會(huì)再形成原酶切位點(diǎn)。利用這種“單向”的連接特性，可設(shè)計(jì)多輪連接以實(shí)現(xiàn)?DNA?片段組裝。根據(jù)此原理設(shè)計(jì)的?BioBrick（生物積塊）法（圖?2b）可用于合成生物學(xué)中相關(guān)元件的標(biāo)準(zhǔn)化組裝，但因其連接處會(huì)留下能編碼終止密碼子的痕跡序列，故不適用于融合蛋白的組裝。為此?Anderson等采用?BglII?和?BamHI?替代?XbaI?和?SpeI，其切割末端連接后產(chǎn)生的痕跡序列可以編碼對(duì)大多數(shù)融合蛋白無影響的“甘氨酸-絲氨酸”連接肽，此策略命名為?BglBrick?法。

基于?IIS型限制性內(nèi)切酶的策略。BioBrick?和BglBrick?法雖然可以實(shí)現(xiàn)高效率的基因部件組裝，但是其無法避免引入額外的痕跡序列。除了同尾酶，限制性內(nèi)切酶中還存在一類?IIS?型限制性內(nèi)切酶，其識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不在同一個(gè)位置，因此可以根據(jù)需要放置內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，以產(chǎn)生所需的黏性末端，用于多片段的無縫連接。2008?年，Engler?等根據(jù)此原理設(shè)計(jì)了?Golden Gate?拼接法，其可在一個(gè)反應(yīng)體系里面實(shí)現(xiàn)多片段的高效無縫連接（圖?2c）。筆者實(shí)驗(yàn)室在?Golden Gate?拼接法的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了?YeastFab和?EcoExpress兩個(gè)組裝系統(tǒng)，用于工程細(xì)胞的代謝通路優(yōu)化和蛋白表達(dá)，可達(dá)?90%?以上的?DNA?拼裝效率。

基于多工具酶聯(lián)合體系。無論是基于同尾酶還是?IIS?型限制性內(nèi)切酶的連接法，由于其產(chǎn)生的黏性末端堿基數(shù)有限，難以支持更大片段的連接。實(shí)際上，體外的?DNA?片段連接，其核心都在于單鏈重疊區(qū)的產(chǎn)生和利用。為克服內(nèi)切酶產(chǎn)生黏性末端長度不足的缺陷，Gibson?等直接放棄限制性內(nèi)切酶，采用?5′?核酸外切酶，聯(lián)合?DNA?聚合酶以及?DNA?連接酶，開發(fā)了?Gibson?組裝法（圖?2d）。此方法一方面可以實(shí)現(xiàn)無縫連接，沒有痕跡序列的殘留；另一方面其能連接獲得的片段大小可達(dá)幾百?kb（千堿基對(duì)），大大提高?DNA?體外組裝所能達(dá)到的量級(jí)。

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