底物選擇性重設(shè)計(jì)

酶催化中心的精確空間結(jié)構(gòu)賦予其高度的底物特異性等特點(diǎn)。面對(duì)紛繁龐雜的底物譜，從自然界中篩選新酶開(kāi)發(fā)的速度遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)今合成生物學(xué)需求，因此改變酶的底物特異性是計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中應(yīng)用最廣泛的方向之一。

2015?年，Baker?課題組通過(guò)計(jì)算設(shè)計(jì)聚甲醛酶，將單碳甲醛分子固定至三碳單元的二羥基丙酮中，從而實(shí)現(xiàn)核心代謝步驟，首次通過(guò)催化元件設(shè)計(jì)指導(dǎo)新型代謝通路合成。他們以苯甲醛裂解酶（benzaldehyde lyase，BAL）為起點(diǎn)，利用?RosettaDesign?以及?Foldit?重新設(shè)計(jì)?BAL?的苯甲醛結(jié)合口袋以增加其對(duì)甲醛的特異性，獲得?7?個(gè)突變氨基酸組成的聚甲醛酶（Formolase，F(xiàn)LS）。該酶對(duì)聚甲醛反應(yīng)的催化效率與原始?BAL?相比增加?100?倍。在甲酸轉(zhuǎn)化為二羥丙酮磷酸鹽途徑中，由甲酸直接還原為甲醛難度很大。為實(shí)現(xiàn)甲酸轉(zhuǎn)化，Baker課題組先將甲酸活化為甲酰基?-CoA，降低熱力學(xué)障礙。隨后通過(guò)?BRENDA?數(shù)據(jù)庫(kù)搜索挖掘能夠?qū)⒓柞；?-CoA?還原為甲醛的酰化醛脫氫酶，并將乙酰輔酶?A?合酶與酰化醛脫氫酶串聯(lián)催化甲酸轉(zhuǎn)化為甲醛。通過(guò)上述設(shè)計(jì)的聚甲醛酶，將甲酸最終轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮。這項(xiàng)工作充分證明了酶分子底物重設(shè)計(jì)能夠有效引導(dǎo)新型代謝途徑設(shè)計(jì)。

酶分子熱穩(wěn)定性設(shè)計(jì)

改善酶熱穩(wěn)定性可提高異源宿主表達(dá)量，提高溫和條件下催化元件活性，并增強(qiáng)酶對(duì)嚴(yán)苛工業(yè)條件（有機(jī)溶劑、高溫、極端?pH?值等）的耐受力。在蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改造方面，使用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)進(jìn)化的方法，蛋白質(zhì)熔解溫度的提高通常小于?15℃。而通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的能量計(jì)算指導(dǎo)的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法則可以突破該局限，甚至可以使蛋白質(zhì)的熔解溫度提高超過(guò)?35℃?以上的水平，獲得具有超熱穩(wěn)定性的蛋白。

目前，針對(duì)酶分子熱穩(wěn)定性改造已發(fā)展出多種策略和算法，其預(yù)測(cè)能量與數(shù)據(jù)庫(kù)值擬合程度最高相關(guān)系數(shù)（R?值）可達(dá)到?0.73（Foldx?程序）。Weiss?團(tuán)隊(duì)利用?SCADS?策略（Statistical, Computationally Assisted Design Strategy，SCADS）對(duì)馬兜鈴烯合成酶進(jìn)行環(huán)境能量打分，檢測(cè)氨基酸側(cè)鏈與周圍骨架、側(cè)鏈，以及所在環(huán)境的相互作用。通過(guò)環(huán)境能量評(píng)估篩選?12?個(gè)打分最高的氨基酸進(jìn)行突變，熔融溫度由?38℃?提升至?83℃。Janssen?課題組通過(guò)?FRESCO?策略（Framework for Rapid Enzyme Stabilization by Computational libraries，F(xiàn)RESCO）對(duì)檸檬烯環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性突變體文庫(kù)構(gòu)建，通過(guò)結(jié)合?10—12?個(gè)單點(diǎn)突變，組合突變體的熔融溫度從?50℃?提高至?85℃，且酶的催化活性增強(qiáng)，半衰期延長(zhǎng)大于?250?倍。他們還利用?FRESCO?策略對(duì)鹵代烷脫鹵酶（haloalkane dehalogenase）LinB?進(jìn)行熱穩(wěn)定性計(jì)算。12?個(gè)穩(wěn)定突變疊加導(dǎo)致?LinB?突變體熔融溫度增加?23℃，并且在?60℃?下半衰期超過(guò)?200?倍。此外，為了提高鹵代醇脫鹵素酶（halohydrin dehalogenase）在有機(jī)溶劑中的耐受性，Janssen?課題組利用?FRESCO?策略確定了?218?個(gè)突變點(diǎn)和?35?個(gè)二硫鍵，具有預(yù)測(cè)的穩(wěn)定效應(yīng)。結(jié)果顯示，組合突變體（HheC-H12）熔融溫度提高?28℃，對(duì)共溶劑的抗性顯著增加。2016?年，F(xiàn)leishman?團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種聯(lián)合計(jì)算策略（protein repair one stop shop，PROSS），設(shè)計(jì)帶有?51?個(gè)突變的乙酰膽堿酯酶（hAChE）突變體，通過(guò)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該突變體可以顯著改善蛋白質(zhì)的核心堆積、表面極性及骨架剛性。與野生型相比，該突變體在大腸桿菌中表達(dá)水平高出?2?000?倍，熱穩(wěn)定性提高?20℃。

多肽的末端功能化對(duì)蛋白質(zhì)生化性質(zhì)具有非常重要的影響。通過(guò)對(duì)?C?端的特異性修飾可以使多肽的體內(nèi)代謝半衰期延長(zhǎng)、免疫原性降低或毒副作用減少。由于多肽結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，化學(xué)修飾步驟多、產(chǎn)率低、難度很大。2016?年，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所研究團(tuán)隊(duì)與荷蘭格羅寧根大學(xué)以及?Enzypep?公司合作，采取一種“FRESCO?與一致性分析聯(lián)合計(jì)算”策略對(duì)多肽酰胺酶進(jìn)行了工程化改造，成功設(shè)計(jì)了一個(gè)經(jīng)過(guò)高度改造的多肽酰胺酶突變體?PAM12A（包含?12?個(gè)突變點(diǎn)）。PAM12A?具有極高的熱穩(wěn)定性（熔解溫度達(dá)到?76℃），并且可以在乙腈、丙酮等多種無(wú)水溶劑環(huán)境中保持?jǐn)?shù)天的穩(wěn)定活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PAM12A?可以催化包括甲酯化、羥胺化、甲胺化、胺化在內(nèi)的多種不同的多肽修飾反應(yīng)，且不受多肽本身序列和?C?端原功能基團(tuán)的限制。